ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Наименование инновационного проекта

Организация производства биологических микрочипов для прогнозирования диагностики заболеваний.

Рекомендуемая область пременения

Медицинские и микробиологические лаборатории.

Назначение, цели и задачи проекта

Целью проекта является создание производства биологических микрочипов для оснащения лабораторий клинических медицинских учреждений.

Краткое описание заменяемого процесса или решаемой проблемы

Биологические микрочипы, технологии создания и производства которых активно развиваются в РФ и за рубежом, являются мощнейшим из существующих инструментов для выявления и идентификации биологических материалов. Основная причина бурного развития технологий с использованием биологических микрочипов связана в первую очередь с возможностью получения обширной информации при использовании малых количеств веществ. В основе применения микрочипов лежит принцип быстрого определения взаимодействий тех или иных лигандов со множеством различных зондов одновременно. К основным причинам широкого распространения биочиповых исследований относят высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость, простоту процедуры выполнения, возможность одновременного анализа множества параметров и относительно невысокую стоимость работ. Эти же причины заставляют рассматривать биочипы как перспективный инструмент в различных областях народного хозяйства. Биочипы применяются для обнаружения бактериальных и вирусных контаминаций в продуктах питания, косметике и окружающей среде, выявления генно-модифицированных организмов в пищевых продуктах, диагностики и прогнозирования различных заболеваний, детекции особо опасных инфекционных агентов в анти-биотеррористических целях и др.

В биологических исследованиях микрочипы широко используются для составления экспрессионных профилей, анализа полиморфизма, выявления молекулярных мишеней, определения видовой специфичности и т.д.

Биочипы - это революционное достижение биотехнологии последних лет. Необычное устройство позволяет за короткое время определять несколько тысяч аллергенов, онкогенов, различных биологически активных веществ, и даже генетических дефектов.

Краткое описание предлагаемого технологического процесса

Собственно биологические микрочипы представляют собой ту или иную твердую подложку, на которой нанесены или определенные фрагменты нуклеиновых кислот, или белки, или углеводы, или какие-либо иные молекулы-зонды, способные быть узнанными или проявлять биологическую активность. Количество различных зондов на подложке может достигать сотен тысяч, причем чипы каждого типа строго идентичны и при существующих технологиях могут быть реплицированы в сотнях тысяч и миллионах копий нанесенных на подложку.

ДНК–чипы представляют собой уникальный аналитический инструмент, позволяющий определять наличие в анализируемом образце (как правило, биологического происхождения) заданных последовательностей ДНК (т.н. гибридизационный анализ). Проведение анализа с помощью ДНК–чипов обходится в несколько раз дешевле, чем при использовании альтернативных технологий (электрофорез, ПЦР в реальном времени) и допускает, при наличии детектора несложной конструкции, работу вне лаборатории. ДНК–чип представляет собой твердую подложку, на которой иммобилизованы (как правило, ковалентно) однонитевые фрагменты ДНК разной длины: короткие – 15-25 нуклеотидов, длинные – 25-60 нуклеотидов и кДНК фрагменты – от 100 до 3000 нуклеотидов. В качестве материала подложки используют стекло, кремний, различные полимеры, гидрогели (например, на основе полиакриламида) и даже золото. Наиболее распространенные подложки – из стекла. Фактически единственный путь их модификации (а также кремниевых подложек) – обработка органотриалкоксисиланами (RO)₃Si-(CH₂)₃-X, где R – CH₃ или C₂H₅, X – NH₂, SH, глицидилокси- и др. В ходе такой обработки происходит образование силоксановых мостиков между модифицирующим реагентом и поверхностными атомами кремния, в результате чего на подложке формируется достаточное количество функциональных групп (как правило, это аминогруппы), используемых для иммобилизации олигонуклеотидов либо непосредственно, либо через несколько стадий формирования «ножки», обеспечивающей большую конформационную свободу олигонуклеотида.

Технология обработки стеклянных подложек, как самая старая, хорошо разработана, отличается простотой, надежностью и эффективностью. Однако трудности, возникающие при необходимости изготовления подложек сложной формы (например, подложки с лунками, позволяющими анализировать несколько различных проб на одном чипе) заставляют искать альтернативы стеклу среди полимерных материалов.

ДНК – чипы на основе полиакриламидного гидрогеля формируются путем сополимеризации акриламида с олигонуклеотидами, содержащими непредельные фрагменты. Преимущество данного метода заключается в высокой плотности иммобилизации олигонуклеотидов, связанной с их объемным, а не поверхностным распределением.

Наиболее перспективным материалом подложек представляются пластмассы, обеспечивающие, в сравнении с традиционным стеклом, экономическую эффективность и гибкость решения.

Разработаны процессы введения функциональных групп на поверхность полимера, основанные на плазмохимической технологии и включающие обработку поверхности полимера разреженной плазмой какого – либо газа, обеспечивающего введение нужной группы (например, под действием плазмы аммиака получается аминированная поверхность). Метод отличается универсальностью по отношению к природе используемого полимера, однако его применение сильно ограничено высокой стоимостью промышленных плазмохимических установок.

Другой подход к разработке эффективных полимерных подложек для изготовления ДНК–чипов заключается в использовании функциональных групп, входящих в состав промышленного полимера. С этой точки зрения наибольший интерес представляет полиметилметакрилат, недорогой и технологичный при изготовлении подложки путем литья в форму с одной стороны, и содержащий удобные для химической модификации сложноэфирные группы с другой стороны.

Таким образом, уровень развития технологии на сегодняшний день не препятствует широкому практическому использованию ДНК–чипов.

В Пущинском научном центре РАН наряду с разработкой исследовательских биочипов и связанных с ними технологий, были предприняты усилия по созданию и внедрению биочипов для прикладных задач. Основными отличиями практических, прикладных задач является то, что, как правило, они предполагают выявление относительно небольшого количества агентов (зондов) в ходе одного анализа (обычно до сотни), но количество требуемых чипов может достигать десятков, а то и сотен тысяч ежемесячно.

На базе Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН совместно с сотрудниками Пущинских Институтов, а также Московской медицинской академии МЗ РФ были созданы биотехнологические производства, обеспечивающие крупномасштабный выпуск биочипов, биохимических наборов для их проявления, а также чип-детекторов с оригинальным программным обеспечением.

В основу анализа был положен подход, заключающийся в ассиметричной мультипраймерной амплификации искомых последовательностей.

Технологии приготовления активированных матриц, разработанные в ИТЭБ РАН с учетом, безусловно, мирового опыта для данной задачи, на сегодня включают в себя 4 варианта активации поверхностей различной природы (стеклянные, разного рода пластики и др.). Одна из них заключаются в аминосиланировании предварительно очищенных стеклянных пластин и строгом контроле качества покрытия путем оценки количества аминогрупп на единицу поверхности. Схема анализа выглядит так:

1. Выделение ДНК

2. Ассиметричная мультипраймерная ПЦР с использованием меченых праймеров

3. Гибридизация ПЦР продуктов с нанесенными на стекло

4. Визуализация результатов гибридизации и анализ изображения

Производство зонда включает в себя от 10 до 12 процессов, большинство из которых можно осуществлять в автоматическом режиме. Анализ прореагировавших чипов производится автоматически с помощью анализатора (чип-детектора), который представляет собой широкопольный микроскоп, соединенный с видеокамерой и компьютером.

Технико-экономическое обоснование применения инновационной технологии

Оборудование и чипы, созданные в целях медицинской диагностики, позволяют выполнять до нескольких тысяч анализов ежедневно, выявляя до 15 антигенов одновременно, масштабировать и стандартизовать проведение и результаты анализов, и расширять спектр анализируемых агентов без существенного увеличения стоимости анализа.

России необходимо не менее 2 млн биочипов в год

Биочиповые технологии, разработанные в ПНЦ РАН, позволяют обеспечить решение практически любых, в том числе прикладных, медико-биологических задач в масштабах всей страны.

В настоящее время в ПНЦ РАН налажен выпуск активированных стеклянных матриц в количестве 10-15 тысяч ежемесячно с возможным расширением в течение пары недель до 30-40 тысяч в месяц. Для примера, комплекс Nunc способен производить 40 тысяч таких стекол ежемесячно.

Следует отметить, что отпускная цена активированных матриц минимум втрое дешевле таковой известных европейских производителей.

Рынок биочипов для исследования ДНК развивается быстрее, так как здесь меньше конкуренция с другими методиками, а значит более благоприятные условия. Именно на этот сегмент стоит делать ставку отечественным производителям.

Технико-экономические показатели трудо-энерго-природосбережения нового процесса

Оборудование и чипы, созданные в целях медицинской диагностики, позволяют выполнять до нескольких тысяч анализов ежедневно, выявляя до 15 антигенов одновременно, масштабировать и стандартизовать проведение и результаты анализов, и расширять спектр анализируемых агентов без существенного увеличения стоимости анализа.

России необходимо не менее 2 млн биочипов в год

Биочиповые технологии, разработанные в ПНЦ РАН, позволяют обеспечить решение практически любых, в том числе прикладных, медико-биологических задач в масштабах всей страны.

В настоящее время в ПНЦ РАН налажен выпуск активированных стеклянных матриц в количестве 10-15 тысяч ежемесячно с возможным расширением в течение пары недель до 30-40 тысяч в месяц. Для примера, комплекс Nunc способен производить 40 тысяч таких стекол ежемесячно.

Следует отметить, что отпускная цена активированных матриц минимум втрое дешевле таковой известных европейских производителей.

Рынок биочипов для исследования ДНК развивается быстрее, так как здесь меньше конкуренция с другими методиками, а значит более благоприятные условия. Именно на этот сегмент стоит делать ставку отечественным производителям.

Новые потребительские свойства продукции

Микрозонды, которые должны взаимодействовать с образцом, наносят на подложку из пластика или стекла размером не больше почтовой марки. Каждый микрозонд имеет форму капельки около 100 микрон в поперечнике. Все ячейки одного макрозонда одинаковы по размеру и располагаются с плотностью 10-30 «капелек» на 1 кв. мм. Те чипы, на которых проходит ферментативная реакция, имеют более редкое расположение ячеек, те, на которых идет ДНК-реакция - более частое. Такая технология позволяет на одном биочипе разместить анализатор фактически всего генома человека - от 30 до 100 тысяч генов. При этом детектируется наличие участков ДНК длиной от шести до нескольких тысяч нуклеотидов в зависимости от поставленной задачи.

Качественные характеристики, предъявляемые к сырью и материалам

Сырье и материалы соответствуют мировым стандартам качества.

Стадия и уровень разработки

В настоящее время в ПНЦ РАН налажен выпуск активированных стеклянных матриц в количестве 10-15 тысяч ежемесячно с возможным расширением в течение пары недель до 30-40 тысяч в месяц.

Предлагаемые инвестиции

3,5 млн. руб.

Рынки сбыта

Медицинские лаборатории РФ.

Возможность и эффективность импортозамещения

Качество активированных матриц, проверяемое по эффективности связывания олигонуклеотидов и ДНК, степени неспецифической сорбции и автофлуоресценции, не уступает, а превосходит качество импортных аналогов (диметокситритилхлорида (DMTrCl)

Возможность выхода на мировой рынок

Срок окупаемости (в месяцах)

24

Дата поступления материала

19.09.2007