ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

Принцип метода основан на осаждении из цельной крови при помощи этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), эритроцитов и выделении центрифугированием эритроцитарной массы. После двукратной отмывки эритроцитов изотоническим раствором натрия хлорида, из них с помощью изопропанол-гептана экстрагируют липиды и последовательно определяют холестерин, общие липиды и антирадикальную активность любым из известных методов.

Приборы: спектрофотометр, фотоэлектроколориметр, центрифуга, термостат.

Реактивы:

1. Натрия этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), раствор 1 мг/мл.

2. Изотонический раствор, натрия хлорид, раствор 0,85%.

3. Этанол, 96%.

4. Хлороформ.

5. Этанольный раствор хлорного железа, 2 мг/л.

6. Смесь гептан-изопропанол (1:1) по объему.

7. Цветной реактив для определения холестерина.

8. Фосфорно-вольфрамовый реактив для определения общих липидов.

9. Хлороводород, раствор, рН 2,0 (0,1 н. НС1 с рН 1,1 разводят водой в соотношении 1:4).

10. 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил, раствор в толуоле, приготовленный таким образом, чтобы величина абсорбции полученного раствора составляла 0,6 при длине волны 517 нм.

11. Стандартный раствор холестерина. 100 мг чистого холестерина растворяют в небольшом количестве ледяной уксусной кислоты, охлаждают и доводят объем до 50 мл.

Ход определения.

Берут цельную кровь, в качестве консерванта используют ЭДТА натрия (0,5 мл 1%-го раствора ЭДТА на 5 мл венозной крови). После центрифугирования при 2000 об/мин в течение 8 мин. и отделения плазмы полученную эритроцитарную массу трижды отмывают двукратным объемом изотонического раствора хлорида натрия с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 7 мин. Затем эритроцитарную массу разводят изотоническим раствором натрия хлорида в 2 раза. К 0,2 мл эритроцитарной массы добавляют 4 мл смеси гептан-изопропанол (1:1) и встряхивают 10-15 мин. на лабораторном встряхивателе. Далее в пробирку добавляют 1 мл раствора хлороводорода (рН 2,0) и 2 мл гептана, интенсивно встряхивают и после отстаивания и расслоения смеси (на что уходит 20-25 мин.) отбирают верхний гептановый слой в сухую пробирку.

Определение холестерина

К 0,1 мл гептанового слоя прибавляют 2 мл цветного реактива, содержимое хорошо перемешивают и оставляют в термостате при температуре +60 ^оС в течение 7 мин. затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и определяют на фотоэлектроколориметре экстинкцию в кюветах с рабочей длиной 5 мм при длине волны 560 нм против цветного реактива. Расчет проводят по калибровочной кривой с раствором, содержащим 1-2 ммоль/л холестерина.

Определение общих липидов

Определение тотальных липидов проводят по реакции с фосфорно-ванилиновым реактивом. К 0,2 мл гептанового слоя прибавляют 1,5 мл концентрированной серной кислоты и гидролизуют в течение 15 мин. на кипящей бане. После охлаждения проб проточной водой (в контрольную пробу вместо гидролизата берут 0,1 мл концентрированной серной кислоты). Тщательно перемешивают, выдерживают пробы при комнатной температуре в течение 50 мин. Оптическую плотность пробы (А1) и эталонного раствора (А2) измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 510-550 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм против контрольного раствора.

Расчет проводят по формуле

тотальные липиды (г/л) = 8 х А1/А2,

где: 8 - концентрация стандартного раствора липидов в г/л. Расчет также можно проводить по калибровочному графику.

Определение антирадикальной активности

К 0,5 мл гептанового слоя приливают 3 мл раствора дифенилпикрилгидразила. Спустя 10 мин. измеряют величину абсорбции при длине волны 517 нм против толуола.

Результат выражают в условных единицах по формуле

А517 х 40 - у.е. на 1 мл эритроцитов.

Количественные сдвиги показателей холестерина, общих липидов и антирадикальной активности в мембранах эритроцитов позволяют судить о содержании холестерина, тотальных липидов и состоянии оксидантно-антиоксидантного баланса в мембранах внутренних органов и могут характеризовать заболевания печени, почек, легких и других органов у животных. Поэтому определение холестерина, общих липидов и антирадикальной активности в мембранах эритроцитов в конечном итоге направлено на сохранение здоровья и поголовья высокопродуктивных животных.