ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

Принцип способа основан на получении экстракта крови, в котором раздельно определяют количественное содержание оксалоацетата спектрофотометрически и общую антиоксидантную активность хемилюминесцентным методом.

Определение состоит из трех этапов: получение экстракта крови, определение количества оксалоацетата и определение общей антиоксидантной активности.

Реактивы:

1. Триэтаноламин-солянокислый буфер, раствор 0,1 М, рН 7,5.

2. Никотинамидадениндинуклеотид восстановленный (НАДН), раствор 0,1 ммоль/л.

3. Хлорная кислота, раствор 0,6 н.

4. Рибофлавин, раствор 10 ммоль/л.

5. Сульфат железа, раствор 25 ммоль/л.

6. Пероксид водорода, раствор 20 ммоль/л.

7. Малатдегидрогеназа, суспензия.

Приборы: спектрофотометр, люминометр, центрифуга.

Ход определения. В центрифужную пробирку последовательно вносят 2 мл 0,6 н. раствора хлорной кислоты и 1 мл крови. Тщательно перемешивают. Через 30 мин. экспозициии пробы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость делят на две части и используют для определения оксалоацетата и общей антиоксидантной активности.

Количественное определение оксалоацетата. Полученный надосадок крови нейтрализуют 2 н. раствором гидроксида калия до рН 7,0. Образовавшийся гипохлорид калия можно осадить, помещая пробирку в лед или центрифугируя. Далее используют надосадочную жидкость. В спектрофотометрическую кювету на 3,0 мл помещают 2,4 мл триэтаноламин-солянокислого буфера, 0,5 мл нейтрализованного экстракта крови, 0,1 мл НАДН. Стартуют путем добавления 0,01 мл суспензии малатдегидрогеназы. Регистрируют убыль оптической плотности при 340 нм. Расчет проводят по формуле

С мкмоль НАДН/мл = ,

где:dЕ - разница между конечной и исходной оптической плотностью,

3 - объем реакционной смеси,

6,22 - коэффициент мкмолярной экстинкции НАДН при 340 нм.

Определение общей антиоксидантной активности. В две пробирки (контрольную и опытную) последовательно вносят 710 мкл фосфатного буфера, рН 9,1, 40 мкл 10 ммоль/л раствора рибофлавина, 50 мкл 25 ммоль/л раствора сульфата железа и 200 мкл 20 ммоль/л раствора пероксида водорода. В опытную пробу вместо 100 мкл фосфатного буфера вносят экстракт крови. Измерение светосуммы хемилюминесценции осуществляют на хемилюминометре при 37 ⁰С в течение 1 мин. Параллельно определяют в сыворотке крови содержание белка биуретовым методом и уровень общих липидов фосфорно-ванилиновым методом. По разности суммы хемилюминесценции опытной и контрольной пробы находят антиоксидантную активность (АОА), которую выражают в единицах хемилюминесценции, отнесенных к 1 мл сыворотки крови, или к 1 мг сывороточного белка, или к 1 мг общих липидов.

Повышение количественного содержания оксалоацетата и снижение общей антиоксидантной активности сыворотки крови может быть связано с повышением процессов свободнорадикального окисления в организме, что характерно для многих заболеваний, поэтому предлагаемый способ имеет значение для сохранения здоровья высокопродуктивного стада животных.