ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

Глутатионредуктаза (К.Ф. 1.6.4.2) катализирует НАДФ ₂ - зависимое восстановление одной молекулы оксиленного глутатиона до двух молекул восстановленной его формы: окисленный глутатион + НАДФН ₂®2 восстановленный глутатион + НАДФ ⁺.

Принцип метода основан на ферментативном преобразовании окисленной формы глутатиона в восстановленную, интенсивность которого может быть определена по скорости снижения экстинкции проб при блине волны 340 нм, на которой раствор НАДФ ⁺ имеет максимальное светопоглощение. Количество используемого в реакции НАДФН ₂ пропорционально активности фермента.

Реактивы: 1. Фосфатный буфер, раствор 0,2 моль/л, рН 7,4.

2. Калия хлорид, раствор 0,1 моль/л.

3. Этилендиаминтетрацетат (ЭДТА), раствор 0,08 моль/л.

4. Глутатион окисленный, раствор 8 ммоль/л в 0,01 н растворе натрия

гидроксида.

5. Никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный

(НАДФН ₂), раствор 2 ммоль/л в 1%-ном растворе натрия бикарбо-

ната.

Ход определения.

В спектрофотометрическую кювету последовательно вносят 1,5 мл раствора калия хлорида, 0,5 мл фосфатного буфера (0,2 моль/л, рН 7,4), 0,25 мл раствора ЭДТА, 0,05 мл исследуемой сыворотки крови (или другой биологической жидкости), 0,1 мл раствора НАДФН ₂ (2 ммоль/л в 1%-ном растворе натрия бикарбоната). Реакцию проводят в течение 10 мин и регистрируют уменьшение поглощения НАДФН ₂ при длине волны 340 нм на спектрофотометре СФ-46 в кювете с длиной оптического слоя 10 мм против дистиллированной воды.

Активность фермента в исследуемой сыворотке крови (или биологической жидкости) рассчитывают по формуле

А= ,

где А - активность фермента, мкмоль/мин на 1 мл сыворотки;

dЕ - изменение оптической плотности за 1 мин;

v- конечный объем в кювете после прибавления последнего компонента,

мл;

0,05 - объем сыворотки крови, добавленный в кювету для определения, мл;

е- коэффициент экстинкции НАДФН ₂l340 нм - 6,22 см ²/мкмоль;

d -толщина слоя кюветы, см.

Поскольку глутатионредуктаза является ферментом, наиболее распространенным в таких тканях как печень, почки, сердце и эритроциты, поэтому предлагаемый способ позволяет улучшить диагностику возможных заболеваний указанных органов животных.