ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

В генетико-токсикологических исследованиях наиболее часто используют тест-систему на основе бактерий группы сальмонелла с мутациями по генам, ответственным за синтез гистидина.

Метод основан на индукции испытываемыми препаратами или их метаболитами генных мутаций у индикаторных штаммов сальмонелл. Используют индикаторные штаммы ТА 1534, ТА 1537, ТА 1535, ТА 1538, ТА 1950, ТА 98 и ТА 100. Наличие мутагенного эффекта исследуемого препарата регистрируется по индукции обратных мутаций от ауксотрофности по гистидину к протрофности путем визуального учета числа колоний ревертантов в опытных и контрольных чашках Петри.

Штаммы ТА 1537, ТА 1538, ТА 1534 и ТА 98 способны регистрировать действие соединений, вызывающих мутации типа сдвига рамки считывания генетического кода, а штаммы ТА 1535 и ТА 1950 обнаруживают мутагенный эффект веществ, индуцирующих мутации типа замены пар оснований. Штамм ТА 100 в ряде случаев способен выявлять эффект мутагенов, действующих по обоим названным молекулярным механизмам.

Для определения генетической токсичности (мутагенности) химических соедине-ний нами разработан полуколичественный метод с внесением препаратов в слой полужидкого агара без метаболитической активации.

Для анализа культуру индикаторного штамма с косяка мясопептонного агара (МПА) переносят петлей в 10 мл мясопептонного бульона (МПБ) и инкубируют без аэрации 18 ч при 37 ^оС. Косяк используют без пересева в течение 3-4 недель.

В день постановки эксперимента 3 мл культуры переносят в 60 мл МПБ и инкубируют в термостате при 37 ^оС совстряхиванием до концентрации 5х10 ⁸ кл/мл, затем переносят в стерильные центрифужные пробирки и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин. Осадок суспензируют в жидкой минимальной среде, разве-денной в 4 раза до концентрации 2 х10 ⁹ кл/мл.

Чашки Петри заливают слоем нижнего минимального агара (по 25 мл) и выдерживают при комнатной температуре в течение 2 ч.

На каждый вариант опыта для каждого штамма используют по 3-4 чашки. Опыт сопровождается чистым и позитивным контролем.

Испытуемый препарат вносят вместе с тест-культурой выбранного штамма в слой верхнего полужидкого агара. В пробирку с 0,6%-м полуобогащенным агаром перед его разливом в чашки вносят 0,1 мл суспензии бактерий и 0,1 мл раствора испытываемого препарата в растворителе. Используют несколько стандартных кон- центраций. Дозы препарата: 0,1; 1; 10; 100 и 1000 мкг на чашку. Если использование дозы 100 мкг затруднительно из-за плохой растворимости препарата, за высокую дозу принимается предел растворимости в условиях эксперимента.

В качестве чистого контроля используют вариант с внесением в слой полужидкого агара 0,1 мл растворителя препарата.

Позитивными контролями служат - для штаммов ТА 1535, ТА 100 и ТА 1950 нитрозометилмочевина (100 мкг на чашку), для штаммов ТА 1538, ТА 1537, ТА 1534 и ТА 98 препарат ДДДТДП (100 мкг на чашку) или 2-нитрозофлуорен (0,5 мкг на чашку) и ряд других соединений.

Пробы с чистым и позитивным контролем высевают в четыре чашки. Для каждого варианта опыта используют по три чашки .

Оценку результатов эксперимента проводят по индукции обратных мутаций от ауксотрофности по гистидину к протрофности. Сравнивают число мутаций в опытных и контрольных чашках. Если количество мутаций в опытных и контрольных чашках не различается более чем в 2,5 раза, делается заключение, что мутагенного эффекта не выявлено. Если число колоний в опытных чашках в 2,5 -10 раз больше, чем в чашках с чистым контролем, то делается заключение о том, что препарат обладает слабой мутагенной активностью.

Число колоний в опытных чашках, превосходящее контроль на один-два порядка, свидетельствует о средней мутагенной активности препарата, а если оно более чем в 100 раз превышает число колоний в чашках с чистым контролем, значит, испытуемый препарат обладает сильной мутагенной активностью.

Результаты эксперимента подвергают статистической обработке. На ее основании делается заключение о наличии или отсутствии мутагенного эффекта у исследуемого препарата.