ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

Принцип метода основан на том, что липопротеины низкой плотности осаждаются гепарином в присутствии солей марганца и затем после центрифугирования удаляются хиломикроны и липопротеины высокой плотности, которые находятся в надосадочной жидкости. Содержание основных классов липидов и ПОЛ определяют любым из известных методов.

Приборы: спектрофотометр, фотоэлектроколориметр, центрифуга, термостат.

Ход определения

В центрифужную пробирку вносят 1 мл сыворотки, 0,25 мл хлорида марганца и добавляют 0,2 мл гепарина в разведении 1:5 (концентрация в 1 мл 1000 ЕД), тщательно перемешивают и ставят на 30 мин в морозильную камеру. Оттаивают пробы и центрифугируют в течение 30 мин. при 2500 об/мин (желательно при температуре 4 - 6 ^оС). Пробирки из центрифуги необходимо вынимать осторожно, чтобы не взмутить осадок. Нижний слой содержит осажденные липопротеины низкой плотности, верхний - растворенные липопротеины высокой плотности, над которым может плавать еще кольцо хиломикронов. Осторожно отсасывают слой, содержащий липопротеины высокой плотности, и удаляют. В осадок добавляют 1,0 мл 2 моль/л сульфата аммония. Затем определяют содержание тотальных липидов, фосфолипидов, холестерина и продуктов ПОЛ.

Определение ПОЛ липопротеинов низкой плотности. В центрифужную пробирку вносят 0,3 мл образца (из растворенного осадка сульфатом аммония), 0,3 мл 1%-ной ортофосфорной кислоты, 0,1 мл 0,6%-го раствора 2-тиобарбитуровой кислоты и 0,1 раствора сульфата железа. Пробирки ставят в кипящую водяную баню на 1 ч. Пробы охлаждают холодной водой, добавляют 4 мл бутанола, тщательно перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Измеряют на спектрофотометре СФ-46 оптическую плотность верхней фазы при длине волны 535 нм против бутанола (Еоп.).

Содержание малонового диальдегида - продукта, характеризующего состояние ПОЛ, рассчитывают по формуле

х = ЕопЧ10 ⁶Ч4/КЧ0,3,

где х - содержание малонового диальдегида (в мкмоль/л или нмоль/л);

4 - объем бутанольной фазы;

К - коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса малонового диальдегида = 1,56Ч10 моль/см;

0,3 - объем жидкости, взятый для анализа.

Определение тотальных липидов проводят по реакции с сульфофосфованилиновым реактивом. К 0,02 мл растворенного осадка ЛПНП прибавляют 1,5 мл концентрированной серной кислоты и кипятят в течение 15 мин на кипящей водяной бане. После охлаждения проточной водой берут 0,1 мл гидролизата и прибавляют 1,5 мл фосфорно-ванилинового реактива (в контрольную пробу вместо гидролизата берут 0,1 мл концентрированной серной кислоты). Тщательно перемешивают, выдерживают пробы при комнатной температуре в течение 50 мин. Оптическую плотность пробы (А1) и эталонного раствора (А2) измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 510-550 нм в кювете толщиной слоя 10 мм против контрольного раствора.

Расчет производят по формуле:

Общие липиды (г/л) = А1/А2.

Можно проводить расчет также по калибровочному графику.

Определение триацилглицеринов проводят при помощи набора химреактивов и используют для анализа 0,1 мл образца ЛПНП.

Определение фосфолипидов во фракции ЛПНП осуществляют колориметрическим методом по содержанию общего фосфора. Для анализа берут 0,2 мл растворенного осадка ЛПНП.

Определение холестерина ЛПНП. 0,1 мл образца растворенного осадка липопротеинов низкой плотности используют для определения холестерина. В пробирку добавляют 2 мл цветного реактива, содержимое хорошо перемешивают и выдерживают пробы в термостате при температуре +60 ^оС в течение 15 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и определяют на фотоэлектроколориметре экстинкцию в кюветах с рабочей длиной 5 мм при зеленом светофильтре (560 нм) против цветного реактива.

Расчет проводят по калибровочной кривой с раствором, содержащим 1-2 ммоль/л холестерина (делают разведение из обычного стандартного раствора).

Повышение продуктов ПОЛ и содержания холестерина липопротеинов низкой плотности свидетельствует о нарушении липидного обмена и может характеризовать заболевания печени у животных.