ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

Принцип метода основан на выделении фракций ЛПВП и ЛПНП. Указанная цель достигается путем осаждения ЛПНП гепарином в присутствии солей марганца и последующим центрифугированием. В надосадочной жидкости находятся ЛПВП. После разделения соответствующих фракций липопротеинов в них определяют количество основных классов липидов и продуктов ПОЛ.

Приборы: спектрофотометр, фотоэлектроколориметр, люминометр, центрифуга, водяная баня, термостат.

Ход определения

В центрифужную пробирку вносят 1 мл исследуемой сыворотки плазмы крови, 0,25 мл 1 М раствора марганца хлорида и добавляют 0,2 мл гепарина в разведении 1:5 (концентрация в 1 мл 1000 ЕД), тщательно перемешивают и ставят на 30 мин в морозильную камеру. Оттаивают пробы и центрифугируют в течение 30 мин при 2500 об/мин при температуре 4 - 6 ⁰С). Пробирки из центрифуги необходимо вынимать осторожно, чтобы не взмутить осадок. Нижний слой содержит осажденные ЛПНП, верхний - растворенные ЛПВП, над которыми может плавать еще кольцо хиломикронов. Пипеткой с тонким носиком осторожно отсасывают слой, содержащий ЛПВП. В осадок добавляют 1,0 мл 2 моль/л сульфата аммония и после растворения последовательно определяют содержание общих липидов, триацилглицеринов, фосфолипидов, холестерина и продуктов ПОЛ. Аналогичные исследования проводят во фракции ЛПВП.

Определение общих липидов проводят по реакции с фосфованилиновым реактивом. Принцип метода заключается в том, что ненасыщенные липиды и жирные кислоты, фосфолипиды и холестерин взаимодействуют после гидролиза серной кислотой с фосфованилиновым реактивом с образованием соединения, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию общих липидов. К 0,2 мл жидкости, содержащей ЛПВП либо ЛПНП, прибавляют 1,5 мл концентрированной серной кислоты и кипятят в течение 15 мин на водяной бане. После охлаждения проб берут 0,1 мл гидролизата и прибавляют 1,5 мл фосфованилинового реактива (в контрольную пробу вместо гидролизата берут 0,1 мл концентрированной серной кислоты). Тщательно перемещают, выдерживают пробы при комнатной температуре в течение 50 мин. Оптическую плотность пробы (А1) и эталонного раствора (Ф2) измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 мм в кювете толщиной слоя 10 мм против контрольного раствора.

Расчет проводят по формуле

общие липиды (г/л) = А1/А2 х В.

Определение триацилглицеринов во фракциях ЛПВП и ЛПНП проводят при помощи набора химреактивов и используют для анализа 0,1 мл жидкости. Триацилглицерины опыляются гидроксидом калия в глицерин, при окислении которого возникает формальдегид. Последний определяют по реакции с метилацетоном и аммониевыми ионами как желтый 3,5-диацетил-1,4-дигидролутидин при длине волны 405 - 420 мм в кювете толщиной слоя 10 мм против контроля, содержащего дистиллированную воду.

Расчет проводят по формуле

триацилглицерины (ммоль/л) = А1/А2 х 3,39.

Определение фосфолипидов во фракциях липопротеинов осуществляют после осаждения трихлоруксусной кислотой и последующей минерализации осадка с помощью 57%-й хлорной кислоты и завершают колориметрическим определением содержания фосфора.

Определение холестерина осуществляют колориметрическим методом: при действии уксусной и серной кислот холестерин в присутствии хлорного железа образует комплекс красно-фиолетового окрашивания. Используют 0,1 мл исследуемой жидкости, содержащей липопротеины. В пробирку добавляют 2 мл цветного реактива, содержимое хорошо перемешивают и выдерживают пробы в термостате при температуре 60 ⁰С в течение 15 мин, затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и определяют на фотоэлектроколориметре экстинкцию в кюветах с рабочей длиной 5 мм при зеленом светофильтре (560 мм) против цветного реактива.

Расчет проводят по калибровочной кривой с раствором, содержащим 1 - 2 ммоль/л холестерина (делают разведение из обычного стандартного раствора).

Определение ПОЛ. В центрифужную пробирку вносят 0,3 мл образца исследуемой жидкости, содержащей липопротеины, 0,3 мл 1%-й ортофосфорной кислоты, 0,1 мл 0,6%-го раствора 2-тиобарбитуровой кислоты и 0,1%-го раствора сульфата железа. Пробирки ставят в кипящую водяную баню на 1 ч. Пробы охлаждают холодной водой, добавляют 4 мл бутанола, тщательно перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин, измеряют на спектрофотометре СФ-46 оптическую плотность верхней фазы при длине волны 535 мм против бутанола (Еоп.).

Содержание малонового диальдегида (МДА) - продукта, характеризующего состояние ПОЛ, рассчитывают по формуле

х = Еоп.Ч4/КЧ0,3,

где х - содержание МДА (в мкмоль/л или ммоль/л);

4 - объем бутанольной фазы;

К - коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса

МДА = 1,54Ч10 моль/см;

0,3 - объем жидкости, взятой для анализа.

Нарушение липидного обмена наблюдается при многих заболеваниях печени, почек и эндокринных органов у животных.