ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

Принцип метода основан на том, что ЛПНП осаждаются гепарином в присутствии солей марганца и затем удаляются центрифугированием, а ЛПВП находятся в надосадочной жидкости, в которой определяют содержание основных классов липидов и продуктов ПОЛ любым из известных методов.

Приборы: спектрофотометр, фотоэлектроколориметр, центрифуга, водяная баня, термостат.

Ход определения

В центрифужную пробирку вносят 1 мл исследуемой сыворотки или плазмы крови, 0,25 мл 1 М раствора марганца хлорида и добавляют 0,2 мл гепарина в разведении 1:5 (концентрация в 1 мл 1000 ЕД), тщательно перемешивают и ставят на 30 мин в морозильную камеру. Оттаивают пробы и центрифугируют в течение 30 мин при 2500 об/мин (желательно при температуре 4 - 6 ⁰С). Пробирки из центрифуги необходимо вынимать осторожно, чтобы не взмутить осадок. Нижний слой содержит осажденные ЛПНП, верхний - растворенные ЛПВП, над которыми может плавать еще кольцо хиломикронов. Пипеткой с тонким носиком осторожно отсасывают слой, содержащий ЛПВП, в котором определяют содержание общих липидов, триацилглицеринов, фосфолипидов, холестерина и продуктов ПОЛ.

Определение общих липидов проводят по реакции с фосфорно-ванилиновым реактивом. К 0,02 мл надосадочной жидкости, содержащей ЛПВП, прибавляют 1,5 мл концентрированной серной кислоты и кипятят в течение 15 мин на кипящей водяной бане. После охлаждения проб проточной водой берут 0,1 мл гидролизата и прибавляют 1,5 мл фосфорно-ванилинового реактива (в контрольную пробу вместо гидролизата берут 0,1 мл концентрированной серной кислоты). Тщательно перемешивают, выдерживают пробы при комнатной температуре в течение 50 мин. Оптическую плотность пробы (А1) и эталонного раствора (А2) измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 510 - 550 нм в кювете толщиной слоя 10 мм против контрольного раствора.

Расчет проводят по формуле

общие липиды (г/л) = А1/А2 х 8.

Можно проводить расчет также по калибровочному графику.

Определение триацилглицеринов ЛПВП проводят при помощи набора химреактивов и используют для анализа 0,1 мл надосадочной жидкости, содержащей ЛПВП.

Определение фосфолипидов во фракции ЛПВП осуществляют колориметрическим методом по содержанию общего фосфора. Для анализа берут 0,2 мл надосадочной жидкости, содержащей ЛПВП.

Определение холестрина ЛПВП.0,1 мл надосадочной жидкости, содержащей ЛПВП, используют для определения холестерина. В пробирку добавляют 2 мл цветного реактива, содержимое хорошо перемешивают и выдерживают пробы в термостате при температуре 60 ⁰С в течение 15 мин, затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и определяют на фотоэлектроколориметре экстинкцию в кюветах с рабочей длиной 5 мм при зеленом светофильтре (560 нм) против цветного реактива.

Расчет проводят по калибровочной кривой с раствором, содержащим 1-2 ммоль/л холестерина (делают разведение из обычного стандартного раствора).

Определение ПОЛ ЛПВП.В центрифужную пробирку вносят 0,3 мл образца надосадочной жидкости, содержащей ЛПВП, 0,3 мл 1%-й ортофосфорной кислоты, 0,1 мл 0,6%-го раствора 2-тиобарбитуровой кислоты и 0,1%-го раствора сульфата железа. Пробирки ставят в кипящую водяную баню на 1 ч. Пробы охлаждают холодной водой, добавляют 4 мл бутанола, тщательно перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин, измеряют на спектрофотометре СФ-46 оптическую плотность верхней фазы при длине волны 535 нм против бутанола (Еоп.).

Содержание малонового диальдегида (МДА) - продукта, характеризующего состояние ПОЛ, рассчитывают по формуле

х = Еоп.Ч10 ⁶Ч4/КЧ0,3,

где х - содержание МДА (в мкмоль/л или нмоль/л);

4 - объем бутанольной фазы;

К - коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса

МДА = 1,56Ч10 моль/см.

0,3 - объем жидкости, взятый для анализа.

Снижение содержания холестерина ЛПВП, либо повышение продуктов ПОЛ свидетельствует о нарушении липидного обмена и может характеризовать заболевания печени у животных.