ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

Принцип метода основан на том, что липопротеины, обладающие электрофоретической подвижностью бета- и пребета-глобулинов, осаждаются гепарином в присутствии солей кальция и затем после центрифугирования удаляются хиломикроны и альфа-липопротеины, которые находятся в надосадочной жидкости. Содержание холестерина определяют любым из известных методов.

Приборы: фотоэлектроколориметр, центрифуга, термостат.

Реактивы:

1. Кальция хлорид, раствор 0,025 моль/л.

2. Гепарин, раствор содержит 1000 ед. в 1 мл (стандартный гепарин разводят 1:5).

3. Аммония сульфат, раствор 0,2 моль/л.

4. Цветной реактив для определения холестерина. Для его приготовления заготовляют 0,1%-й раствор хлорного железа в ледяной уксусной кислоте. Три части полученного раствора смешивают с двумя частями концентрированной серной кислоты (х.ч.) и охлаждают до комнатной температуры.

5. Стандартный раствор холестерина. 100 мг чистого холестерина растворяют в небольшом количестве ледяной уксусной кислоты, охлаждают и доводят объем до 50 мл.

Ход определения

В центрифужную пробирку вливают 2 мл хлорида кальция 0,025 моль/л и вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки крови или плазмы, добавляют 0,04 мл гепарина в разведении 1:5 (концентрация в 1 мл 1000 ед.), тщательно перемешивают и ставят на 30 мин. в морозильную камеру. Оттаивают пробы и центрифугируют в течение 30 мин при 2500 об/мин (желательно при температуре 4 - 6 ^оС). Пробирки из центрифуги необходимо вынимать осторожно, чтобы не взмутить осадок. Нижний слой содержит осажденные бета- и пребета-липопротеины, верхний - растворенные альфа-липопротеины, над которым может плавать еще кольцо хиломикронов. Осторожно отсасывают слой, содержащий альфа-липопротеины, и удаляют. В осадок добавляют 0,2 мл 2 моль/л сульфата аммония. 0,1 мл образца используют для определения холестерина. В пробирку добавляют 2 мл цветного реактива, содержимое хорошо перемешивают и выдерживают пробы в термостате при температуре +60 ^оС в течение 15 мин., затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и определяют на фотоэлектроколориметре экстинкцию в кюветах с рабочей длиной 5 мм при зеленом светофильтре (560 нм) против цветного реактива.

Расчет проводят по калибровочной кривой с раствором, содержащим 1-2 ммоль/л холестерина (делают разведение из обычного стандартного раствора).

Повышение содержания бета-холестерина свидетельствует о нарушении липидного обмена и может характеризовать заболевания печени у животных.