ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

Принцип метода основан на осаждении из цельной крови при помощи этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) эритроцитов и выделении центрифугированием эритроцитарной массы. После отмывки эритроцитов дважды изотоническим раствором хлорида натрия в мембранах эритроцитов определяют альфа-токоферол и холестерин любым из известных методов.

Приборы: спектрофотометр, фотоэлектроколориметр, центрифуга, термостат.

Реактивы:

1. Натрия этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), раствор 1 мг/мл.

2. Изотонический раствор, хлорид натрия, раствор 0,85%.

3. Изопропанол.

4. Гексан.

5. Этанол, 96%.

6. Хлороформ.

7. Этанольный раствор хлорного железа, 2 г/л.

8. Этанольный раствор альфа-2,альфа-2-дипиридила, 20 г/л.

9. Цветной реактив для определения холестерина.

10.Стандартный раствор холестерина. 100 мг чистого холестерина растворяют в небольшом количестве ледяной уксусной кислоты, охлаждают и доводят объем до 50 мл.

11.Стандартный раствор альфа-токоферола, 50 мг/л. Готовят путем раство-рения точно взятой навески альфа-токоферола в соответствующем объеме хлоро-форма.

Ход определения

Берут цельную кровь, в качестве консерванта используют ЭДТА натрия (1 мг/мл). После центрифугирования при 2000 об/мин в течение 5-8 мин и разделения по-лученная эритроцитарная масса трижды отмывается двукратным объемом изотони-ческого раствора хлорида натрия и центрифугируется при 3000 об/мин в течение 7 мин. Затем эритроцитарная масса разводится изотоническим раствором хлорида натрия в 2 раза.

Определение холестерина

Для анализа берут 1 мл эритроцитарной взвеси, приливают 3 мл изопропанола, встряхивают в течение 15 мин и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. К 0,1 мл надосадочной жидкости прибавляют 2 мл цветного реактива, содержимое хорошо перемешивают и оставляют в термостате при температуре +60 ⁰С в течене 15 мин, затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и определяют на фотоэлектроколориметре экстинкцию в кюветах с рабочей длиной 5 мм при длине волны 560 нм против цветного реактива. Расчет проводят по калибровочной кривой с раствором, содержащим 1-2 ммоль/л холестерина.

Определение альфа-токоферола

В обычную химическую пробирку вносят 1,0 эритроцитарной массы, 2,5 мл этанола и, после перемешивания, 5,0 мл гексана. Содержимое пробирки тщательно перемешивают, центрифугируют, отсасывают верхний гексановый слой. Органическую жидкость выпаривают на водяной бане. К сухому остатку добавляют 0,2 мл хлороформа, 2,0 мл 96%-го этанола, 0,2 мл этанольного раствора дипиридила и 0,2 мл этанольного раствора хлорного железа.

Для постановки контрольной пробы в чистую химическую пробирку вносят 0,2 мл хлороформа, 2,0 мл 96%-го этанола, 0,2 мл раствора хлорного железа. Стандарт-ную пробу выполняют аналогично контрольной, с той лишь разницей, что вместо 0,2 мл хлороформа берут 0,2 мл этанольного раствора альфа-токоферола.

Опытную и стандартную пробы фотометрируют в кювете с толщиной слоя 10 м при длине волны 540 нм относительно контрольной пробы, через 10 мин после добав-ления реактивов.

Расчет результатов осуществляют по формуле

С (мг/л) = А _оп : А _стЧ50,

где: А _оп и А _ст - экстинкция опытной и стандартной проб,

50 - концентрация альфа-токоферола (50 мг/л).

Количественные сдвиги в содержании альфа-токоферола и холестерина в мембранах эритроцитов позволяют судить о состоянии мембран внутренних органов - печени, почек, легких и др. Поэтому определение холестерина и альфа-токоферола в конечном итоге направлено на сохранение здоровья и поголовья высокопродуктивных животных.