ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

Бактерицидное действие фагоцитирующих клеток определяется системами ферментной и неферментной природы, активность которых может быть обусловлена зависимыми и независимыми от кислорода механизмами. В последние годы важное клинико-диагностическое значение приобретает определение функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов по результатам пробы НСТ-теста (восстановление нитросинего тетразолия).

Принцип теста состоит в том, что при активации фагоцитирующих клеток происходит восстановление растворимого бесцветного тетразолия нитросинего в диформазан, который распределяется в цитоплазме или на поверхности фагоцитов в виде гранул, окрашенных в темно-синий цвет. Этот тест отражает степень активации кислородозависимых механизмов бактерицидной активности фагоцитирущих клеток.

По информативности НСТ-тест превосходит все другие цитохимические методы оценки активности фагоцитирующих клеток.

Различают спонтанный НСТ-тест с интактными полиморфно-ядерными лейкоцитами, не подвергавшимися воздействию стимуляторов, и стимулированный.

Мы использовали и отработали метод спонтанного НСТ-теста при исследовании крови крупного рогатого скота.

Ходопределения. К 50 мкл крови с гепарином прибавляют 20 мкл фосфатного буфера и 20 мкл раствора НСТ (окрашенная тест-система). Пробирки встряхивают и ставят на 30 мин. в термостат при 37 ^оС. Затем делают мазки крови общепринятым способом, которые фиксируют в метаноле в течение 7 - 10 мин., промывают водой, высушивают и красят метиленовым зеленым 10 мин., снова промывают водой и просушивают.

Учетрезультатов: под микроскопом, пользуясь иммерсионной системой, производят подсчет 200 нейтрофилов и определяют процент положительно реагирующих НСТ-клеток. В цитоплазме клеток, положительно реагирующих с НСТ, отмечается выпадение гранул формазана фиолетово-синего цвета. В цитоплазме отрицательно реагирующих с НСТ-клеток гранулы формазана отсутствуют. При оценке результатов НСТ-теста подсчитывали процент клеток, содержащих массивные отложения формазана. В связи с трудностью определения критериев массивности считали все клетки, содержащие ясно видимые отложения формазана. Кроме того, оказалось целесообразно проведение полуколичественной оценки. По степени активности реакции все клетки были разбиты на четыре группы:

0-я группа - нейтрофилы без гранул,

1-я группа - включали нейтрофилы, у которых гранулы формазана занимали 1/4 - 1/3 цитоплазмы (1-я степень активности),

2-я группа - нейтрофилы, у которых вся цитоплазма заполнена гранулами формазана, но имеются участки разряженности (2-ястепень активности),

3-я группа - нейтрофилы, у которых цитоплазма вся заполнена гранулами формазана, которые порой перекрывают ядро, и клетка напоминает кляксу (3-я степень активности).

Показатели интенсивности НСТ-теста выражали в процентах и условных единицах. В предварительных опытах проведено исследование воспроизводимости данного метода на нормальных и патологических величинах. Коэффициент вариации для здоровых коров составил 9,4%, для больных различной патологией 5%, что соответствует удовлетворительной воспроизводимостиметода.

В результате исследований было установлено, что у здоровых коров черно-пестрой породы только 5 - 14% нейтрофилов способны восстанавливать НСТ.

Закономерное увеличение способности нейтрофильных гранулоцитов восстанавливать НСТ было показано при гнойных маститах и эндометритах на 25 - 30%, а тетразолиевая активность в 2-3 раза превышала уровень у здоровых коров. Показания НСТ-теста адекватно отображали течение заболевания и его тяжесть. Отмечено повышение НСТ-теста при лейкозе (у положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии коров).

Таким образом, на основании наших данных можно заключить, что повышение активности показателей НСТ-теста свидетельствует об активизации фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов при гнойных маститах и эндометритах. Закономерное изменение способности лейкоцитов восстанавливать НСТ в динамике инфекционного процесса бактериальной и вирусной (лейкозы) этиологии, а также простота, доступность в проведении, высокая чувствительность, воспроизводимость и информативность полученных результатов позволяет рекомендовать НСТ-тест для широкого клинического применения как один из объективных методов исследования функциональной метаболической активности нейтрофильных гранулоцитов.