ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

Принцип метода. Гидроксипролин подвергают окислению хлорамином Б, а затем продукты его окисления конденсируют пара-диметиламинобензальдегидом, при этом образуется красного цвета хромоген.

Приборы: спектрофотометр, центрифуга, водяная баня.

Реактивы: хлорная кислота - 57%; трихлоруксусная кислота - 5%; фенолфталеин, раствор - 0,1% в 95%-м этаноле; натрия гидроксид, раствор 24%; хлорамин Б, 7%-й раствор в 0,1 М фосфатном буфере, рН 8,0; пара-диметилбензальдегид, 10%-й раствор в 95%-м этаноле; четыреххлористый углерод; н-Бутанол; водные растворы, содержащие 1, 5, 10, 20 мкг гидроксипролина в 4 мл; активированный уголь; натрия хлорид, насыщенный раствор.

Ход определения

В центрифужную пробирку вносят 1 мл сыворотки крови, 1 мл 5%-й трихлоруксусной кислоты и 1 мл 5%-й хлорной кислоты, перемешивают и, спустя 5 мин, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5-6 мин.

Надосадочную жидкость количественно переносят в центрифужную пробирку, нейтрализуют 24%-м раствором гидроксида натрия до рН=6,0, добиваясь появления устойчивой слабопурпурной окраски (при завершении нейтрализации реактив гидроксид натрия лучше добавлять на кончике стеклянной палочки). Дальше в этой пробе определяет свободный гидроксипролин.

К осадку добавляют 1 мл дистиллированной воды, 1 мл 5%-го раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл 57%-й хлорной кислоты. Смесь закрывают каплеуловителем и гидролизуют в кипящей водяной бане в течение 6 час. К охлажденной до 18-22 ^оС смеси добавляют 0,2-0,4 г активированного угля, встряхивают и центрифугируют 5-6 мин при 3000 об/мин. Прозрачную часть гидролизата нейтрализуют 24%-м раствором гидроксида натрия в мерной центрифужной пробирке, в которой дальше определяют белковосвязанный гидроксипролин.

Параллельно готовят контрольную пробу, которая содержит 4 мл дистиллированной воды. Для определения гидроксипролина во все пробирки добавляют по 1 мл раствора хлорамина Б. Содержимое тщательно перемешивают встряхиванием при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем приливают по 1 мл 57%-й хлорной кислоты, содержимое перемешивают 5 мин, приливают по 1 мл пара-диметилбензаль-дегида. Смесь тщательно перемешивают многократным отряхиванием и помещают в водяную баню при температуре 60 ^оС на 20 мин. Затем пробирки охлаждают проточной водопроводной водой до комнатной температуры, добавляют по 0,5 мл насыщенного раствора натрия хлорида, 1 мл четыреххлористого углерода и 3 мл н-бутанола. Содержимое пробирок тщательно встряхивают, центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин. Измеряют оптическую плотность супернатанта на спектрофотометре при длине волны 557 нм против контроля. Окраска устойчива в течение 1 часа.

Содержимое свободного гидроксипролина (1-я пробирка) и белковосвязанного гидроксипролина (2-я пробирка) рассчитывают по калибровочной кривой и выражают в микромолях на 1 л сыворотки крови.

Для анализа используют свежевыделенные биологические жидкости. При необходимости пробы до анализа можно хранить в замороженном состоянии. В условиях дефицита биологической жидкости, ее можно брать в объеме 1 мл, одновременно сокращая объем трихлоруксусной кислоты и хлорной кислоты, добавляемых для осаждения белков, вдвое.

Увеличение концентрации свободного гидкроксипролина в биологических жидкостях свидетельствует об интенсификации распада коллагенов белков, что наблюдается при деструктивных и воспалительных процессах в соединительной ткани, а повышение белковосвязанного гидроксипролина более выраженно повышается при интенсификации фибриллогенеза.

Следовательно, измерение количества свободного и белковосвязанного гидроксипролина имеет значение для диагностики заболеваний соединительной ткани, поэтому предлагаемый способ позволяет улучшить диагностику возможных заболеваний у животных, что в конечном итоге имеет значение для сохранения здоровья и поголовья высокопродуктивного стада.