ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

Способ основан на осаждении липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) гепарином в присутствии солей марганца и отделением их центрифугированием от остальных классов липопротеинов. Липидный состав и продукты перекисного окис-ления липидов (ПОЛ) изучают известными методами.

Ход определения состоит в следующем. В центрифужную пробирку вносят 1 мл исследуемой сыворотки крови или плазмы, 0,2 мл раствора гепарина (1000 ЕД/мл), 0,25 мл 1М раствора хлорида марганца и инкубируют на льду в течение 30 мин. Затем пробу центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость, содержа-щую липопротеины высокой плотности, удаляют. Осадок, содержащий ЛПНП, раство-ряют в 1 мл 2М раствора сульфата аммония. Затем последовательно определяют то-тальные липиды, триацилглицерины, холестерин и продукты перекисного окисления липидов.

Определение тотальных липидов проводят по реакции с сульфофосфованили-новым реактивом. К 0,02 мл растворенного осадка ЛПНП прибавляют 1,5 мл концентри-рованной серной кислоты и кипятят в течение 15 мин на кипящей водяной бане. После охлаждения проточной водой, берут 0,1 мл гидролизата и прибавляют 1,5 мл фосфор-но-ванилинового реактива (в контрольную пробу вместо гидролизата берут 0,1 мл концентрированной серной кислоты). Тщательно перемешивают, выдерживают пробы при комнатной температуре в течение 50 мин. Оптическую плотность пробы (А1) и стандартного раствора (А2) измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 515 нм в кювете толщиной слоя 10 мм против контроля.

Расчет производят по формуле

тотальные липиды (г/л) = 8ЧА1/А2,

где: 8-концентрация стандартного раствора липидов, г/л.

Определение содержания триацилглицеринов проводятпосле экстрагирова-ния из липопротеиновой фракции. Освобожденный в результате щелочного гидролиза глицерол окисляют до формальдегида с помощью метаперйодата натрия. Образо-вавшийся формальдегид дает с ацетилацетоном 3,5-диацетил-1,4-дигидролутидин, интенсивность которого пропорциональна содержанию триацилглицеринов.

Определение проводят следующим образом. К 0,5 мл раствора ЛПНП добав-ляют 2,0 мл гептана, 3,5 мл изопропилового спирта и 1,0 мл раствора серной кислоты. Содержимое пробирки тщательно перемешивают в продолжение 20 с, оставляют стоять в течение 5 мин и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.

К 0,4 мл верхнего слоя жидкости приливают 2,0 мл изопропилового спирта и 1 каплю КОН. Содержимое пробирки тщательно перемешивают на протяжении 15 с. Пробирку закрывают пробкой и нагревают на водяной бане при 70 ^оС, после чего измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при длине волны 410-430

нм в кювете сшириной слоя5 мм. Результаты сравнивают с аналогичными данными контрольной пробы.

Контрольную пробу ставят так же, как опытную, но вместо липопротеиновиспо-льзуют 0,5 мл дистиллированной воды.

Стандартную пробу проводят так же, как опытную, но вместо липопротеинов используют 0,5 мл калибровочного раствора.

Расчет производят по формуле

Соп (ммоль/л) = Аоп : АстЧ2,3,

где: 2,3 - концентрация триацилглицеринов в стандартном растворе (ммоль/л).

Определение холестерина ЛПНП осуществляют следующим образом. К 0,1 мл

образца растворенного осадка ЛПНП добавляют 2,0 мл цветного реактива, содержимое

хорошо перемешивают и выдерживают пробы в термостате при температуре 60 ^оС в течение 15 мин, затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и определяют на фотоэлектроколориметре экстинкцию в кювете с рабочей длиной 5 мм при длине волны 560 нм против цветного реактива.

Расчет проводят по калибровочному графику с раствором, содержащим 1-2 ммоль/л холестерина.

Определение продуктов ПОЛ. В центрифужную пробирку вносят 0,3 мл растворенного осадка ЛПНП, 0,3 мл 1%-й ортофосфорной кислоты, 0,1 мл 0,6%-го раствора 2-тиобарбитуровой кислоты и 0,1 мл раствора сульфата железа. Пробирки ставят в кипящую водяную баню на 1 ч. Пробы охлаждают проточной водой,добавляют 4 мл бутанола, тщательно перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Измеряют на спектрофотометре СФ-46 оптическую плотность верхней фазы при длине волны 535 нм против бутанола (Еоп.)

Содержание малонового диальдегида (МДА) - конечного продукта перекисного окисления липидов, рассчитывают по формуле

МДА (мкмоль/л) = Еоп.Ч10⁶Ч4/КЧ0,3,

где: 4-объем бутанольной фазы,

0,3-объем жидкости, взятый для анализа,

К-коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса малонового диальдегида = 1,56Ч10⁵моль/см.

Сдвиги липидного состава ЛПНП и повышение продуктов перекисного окис-ления липидов могут указывать на возможные заболевания у животных, поэтому применение данного способа направлено на сохранение здоровья высокопродуктив-ного стада животных.