ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

Принципспособа основан на том, что ЛПНП осаждаются гепарином в присут-ствии солей марганца и затем удаляются центрифугированием,а ЛПВП находятся в надосадочнойжидкости, в которой определяют содержание основных классов липидов и продуктов ПОЛ любым из известных методов.

Ход определения

Вцентрифужную пробирку вносят 1 мл исследуемой сыворотки или плазмы крови, 0,25 мл раствора хлорида марганца и добавляют 0,2 мл гепарина в разведении 1:5 (концентрация в 1 мл 1000ЕД),тщательно перемешивают и ставят на 30 мин в морозильную камеру.

Оттаивают пробы и центрифугируют в течение 30 мин при 2500 об/мин(жела-тельно при температуре 4-6 ^оС). Пробирки из центрифуги необходимовынимать осто-рожно, чтобы не взмутить осадок. Нижний слой содержит осажденные ЛПНП, верхний - растворенные ЛПВП, над которымможет плавать еще кольцо хиломикронов. Пипеткойс тонким носиком осторожно отсасывают слой, содержащий ЛПВП, в котором определяютсодержание тотальных липидов, триацилглицеролов, фосфоглицеридов холес-терина и продуктов ПОЛ.

Определение тотальныхлипидов проводят по реакции сфосфорно-ванилино-вым реактивом. К 0,02 мл надосадочнойжидкости, содержащейЛПВП, прибавляют1,5 мл концентрированной серной кислоты и кипятят в течение15 мин на кипящейводяной бане. После охлаждения проб проточнойводойберут 0,1 мл гидролизата и прибавляют 1,5 млфосфорно-ванилинового реактива (в контрольную пробу вместо гидролизата берут 0,1 мл концентрированной серной кислоты).Тщательно перемешивают, выдер-живают пробы при комнатной температуре в течение 50 мин. Оптическую плотность пробы (А ₁) и эталонного раствора(А₂)измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 510-550 нм вкювете с толщиной слоя 10 мм против контрольного раствора.

Расчет проводят по формуле: тотальные липиды (г/л) =А ₁/А ₂Ч8.

Можнопроводить расчет также по калибровочному графику.

Определение триацилглицеролов ЛПВП проводят при помощи набора химреак-тивов и используютдля анализа 0,1мл надосадочнойжидкости, содержащейЛПВП.

Определение фосфоглицеролов во фракцииЛПВПоуществляютколоримет-рическимметодом по содержаниюобщегофосфора. Для анализа берут 0,2 мл надоса-дочнойжидкости, содержащей ЛПВП.

Определение холестеролаЛПВП.0,1 мл надосадочной жидкости, содержащейЛПВП,используют для определения холестерола. В пробирку добавляют 2 мл цветного реактива, содержимое хорошо перемешивают и выдерживают пробыв термостате при температуре 60 ^оС в течение 15мин, затемпробирки охлаждают до комнатнойтемпературы и определяют нафотоэлектроколориметре экстинкциювкюветах с рабочейдлиной5ммпризеленомсветофильтре (560нм) против цветного реактива.

Расчет проводят по калибровочнойкривойсраствором,содержащим1-2ммоль/л холестерола (делают разведение из обычного стандартного раствора).

Определение продуктов ПОЛЛПВП.Вцентрифужнуюпробиркувносят 0,3 мл образца надосадочной жидкости, содержащейЛПВП,0,3 мл 1%-йортофосфорнойкислоты,0,1мл 0,6%-го раствора 2-тиобарбитуровой кислоты и 0,1 мл раствора сульфата железа. Пробирки ставят в кипящую водяную банюна 1 час.Пробыохлаждают, добавляют 4млбутанола,тщательно перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин,измеряют на спектрофотометре СФ-46 оптическуюплотностьверхней фазы при длине волны 535 нм против бутанола (Е _оп).

Содержаниемалонового диальдегида(МДА) - конечного продукта, характеризующего состояние ПОЛ, рассчитывают по формуле:

Х = Е _опЧ10 ⁶Ч4/КЧ0,3 = Е _опЧ85,47

где: Х - содержание МДА (в мкмоль/л или нмоль/л);

4 - объем бутанольной фазы;

К - коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса МДА = 1,56Ч10 ⁵ моль/см;

0,3 - объем жидкости, взятый для анализа.

Снижение содержания холестерола ЛПВП, либо повышение продуктов ПОЛ,свидетельствует онарушении липидного обмена иможет характеризовать заболевания печени у животных, поэтому определение содержания продуктов ПОЛ и других классов липидного спектралипопротеинов высокойплотности в сыворотке крови в конечномитогенаправлено на сохранение здоровья высокопродуктивного стадаживотных.