ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

Способоснован на получении из исследуемой биологической жидкости путем обработки раствором трихлоруксусной кислоты двух фракций - кислоторастворимой и осадка белков. В первой определяют содержание среднемолекулярных пептидов, креатинина и мочевины; во второй - количество белка.

Приборы: спектрофотометр СФ-46, фотоэлектроколориметр, центрифуга. Реактивы:

1. Трихлоруксусная кислота, раствор 100 г/л (10%).

2. Биуретовый реактив.

3. Гидроксид натрия, раствор 1,1 н.

4. Диацетилмонооксим, водный раствор 2,5%.

5. Тиосемикарбазид, раствор 0,25%.

6. Цветной реактив на мочевину: к 30 мл рабочего раствора хлорного железа добавляют 20 мл дистиллированной воды, 1 мл 2,5%раствора диацетилмонооксима и 0,25 мл раствора тиосемикарбазида.

7. Пикриновая кислота, насыщенный раствор.

8. Соляная кислота, 0,1 моль/л.

9. Стандартные растворы белка, мочевины и креатинина.

Ход определения

Вцентрифужные пробирки вносят 1 мл сыворотки крови и 0,5 мл раствора 10%-й трихлоруксусной кислоты. Через 10 мин пробы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин. В надосадочной жидкости определяют уровень средне-молекулярных пептидов, креатинина и мочевины.

Определение уровня среднемолекулярных пептидов. К 0,5 мл надосадочной жидкости прибавляют 4,5 мл дистиллированной воды и измеряют содержание среднемолекулярных пептидов на спектрофотометре СФ-46 в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм. Уровень выражают в единицах экстинкции (показатель умножают на 100). За норму принята величина 24 ед., полученная при статистической обработке результатов исследования 200 проб здоровых животных.

Определение мочевины проводят по цветной реакции с диацетилмонооксимом. Принцип способа состоит в том, что мочевина с диацетилмонооксимом в присутствии тиосемикарбазида и солей железа в кислой среде образует окрашенное соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию мочевины в сыворот-ке крови.

К 0,5 мл надосадочной жидкости прибавляют 5 мл цветного реактива и выдерживают в кипящей водяной бане в течение 10 мин, охлаждают под водопро-водной водой. Параллельно обрабатывают холостую пробу и стандартный раствор. На фотоэлектроколориметре против холостой пробы определяют экстинкцию опытного раствора и стандарта при зеленом светофильтре в кювете с рабочей длиной 10 мм.

Определение креатинина проводят по цветной реакции Яффе. Креатинин реагирует спикриновой кислотой в щелочной среде с образованием окрашенных соединений.

К 2 мл надосадочной жидкости в разведении 1:10 прибавляют 0,4 мл насыщен-ного раствора пикриновой кислоты и 0,4 мл раствора 10%-го натрия гидроксида. Через 10 мин доводят объем до 10 мл дистиллированной водой. Фотометрируют при фиоле-товом светофильтре№4 в кювете с рабочей длиной 10 мм против холостой пробы. Параллельно обрабатывают стандартную пробу. Расчет проводят по правилу пропор-ций или по калибровочному графику.

Определение белка проводят биуретовым методом, принцип которого состоит в том, что белки в щелочной среде с сульфатом меди образуют соединения, окрашенные в фиолетовый цвет.

К осадку, полученному после центрифугирования, прибавляют 3 мл этанола (96%) и стекляной палочкой ресуспендируют, затем центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость удаляют. Повторно проводят ресуспенди-рование и центрифугирование с 3 мл спирто-эфирной смеси и 3 мл эфира. К высушен-ному таким образом осадку прибавляют 1 мл раствора 1,1 н натрия гидроксида и 4 мл биуретового реактива. В контрольные пробирки прибавляют 1 мл щелочи и 4 мл биуре-тового реактива. Опытные и контрольные пробы ставят на 10 мин в кипящую баню, затем охлаждают и колориметрируют против контроля при 540нм. Количество белка рассчитывают по калибровочному графику.

Расширение диапазона определения биохимических показателей белкового обмена в одной пробе биологического материала значительно расширяет диагности-ческие возможности исследования обмена протеинов. Поэтому способ позволяет улучшить диагностику возможных заболеваний у животных, что в конечном итоге имеет значение для сохранения здоровья и поголовья высокопродуктивного стада.