ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

Аргинин-амидиногидролаза (КФ 3.5.3.1) - фермент цикламочевино-образова-ния, специфически гидролизует аргинин с образованием орнитина и мочевины:

l-аргинин + Н ₂О®l-орнитин + мочевина.

Принцип способа. Гидролиз l-аргинина в присутствии фермента аргинин-ами-диногидролазы сопровождается образованием мочевины, количество которой измеря-ют колориметрически по цветной реакции с диацетилмонооксимовым реактивом.

Реактивы:

1. Аргинин, раствор 0,2 ммоль/л.

2. Хлорид магния, раствор 0,5 ммоль/л.

3. Глициновый буфер, 0,2 моль/л, рН 9,5.

4. Трихлоруксусная кислота, раствор 120 г/л (12%).

5. Мочевина, стандартный раствор 16,65 ммоль/л.

6. Диацетилмонооксимовый реактив: 0,5 ммоль диацетилмонооксима, 0,08 ммоль тиосемикарбазида, 2,5 мкмоль трехвалентного железа растворяют в 50 мл 0,9 ммоль/л серной кислоты.

Ход определения

В химически чистые центрифужные пробирки вносят 1,8 мл глицинового буфе-ра, рН 9,5, 20 мкмоль аргинина, 5 мкмоль хлорида магния, 0,2 мл сыворотки крови. Контролем служат пробы со всеми вышеуказанными реактивами, инактивированными прибавлением 0,5 мл 12%-ного раствора холодной трихлоруксусной кислоты. Далее пробы инкубируют в ультратермостате в течение 30 мин при температуре 37 ^оС. В опыте реакцию останавливают прибавлением 0,5 мл 12%-го раствора холодной трихлоруксусной кислоты. Через 10 мин стояния проб в холодильнике, их центри-фугируют при 3000 об/мин в течение10 минут. Далее в надосадочной жидкости после нейтрализации определяют количество мочевины диацетилмонооксимовым методом. Для этого в тонкостенные пробирки отмеривают 0,1 мл центрифугата, добавляют 2 мл диацетилмонооксимового реактива и содержимое хорошо перемешивают. Отверстие пробирки закрывают алюминиевой фольгой и пробирку помещают точно на 10 мин на кипящую водяную баню. Затем пробирки быстро охлаждают в потоке холодной воды и измеряют оптическую плотность при длине волны 490-540 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм против холостого опыта: к 0,1 мл дистиллированной воды прибавляют 2,0 мл диацетилмонооксимового реактива. Далее пробу обрабатывают так же, как опытную. Стандартные пробы ставят так же,как и опытные, но вместо центри-фугата берут стандартный раствор мочевины, разбавленный перед употреблением.

На основании полученных значений строят калибровочную кривую. Расчет проводят по калибровочному графику.

Разница между содержанием мочевины в опытной и контрольной пробах дает представление о количестве мочевины, образовавшейся в процессе аргинин амидино-гидролазной реакции для исследуемой сыворотки крови.

Параллельно определяют содержание белка биуретовым методом. Активность фермента выражают в ммоль мочевины на 1 мг белка иливмоль мочевины на 1 мл сыворотки крови за 1 час инкубации.

В нормальной сыворотке крови активность фермента не определяется, поэтому активность аргинин-амидиногидролазы сыворотки крови является высокоспецифичес-ким индикатором повреждения клеток печени.