ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Для определения ферментативной активности в белковых фракциях, получаемых при хроматографической очистке изоформ рибонуклеаз, разработан метод оценки активности ферментов по интенсивности гидролиза РНК, иммобилизованной в агарозном геле.

Готовится 1,5%-ный субстратный гель толщиной 1,0-1,5 мм, содержащий 1 мг/мл дрожжевой РНК. В готовом геле с помощью вакуумного резака выполняется ряд отверстий диаметром 2 мм, в которые вносятся образцы. Гель помещают во влажную камеру и инкубируют при температуре 37 ⁰С. Продолжительность инкубации варьируется от 30 минут до 1,5 часов. После завершения реакции гель окрашивают в течение 30 минут 0,2%-ным раствором толлуидиного синего в 0,5%-ной уксусной кислоте (также можно использовать метиленовый синий). Отмывают гель в водопроводной воде и высушивают на листе фильтровальной бумаги прибором для сушки гелей (lkb, Швеция). Зоны РНКазной активности проявляются как светлые пятна на синем фоне. Относительная РНКазная активность определяется интенсивностью и диаметром неокрашенного пятна гидролизованной РНК.

Кроме качественного обнаружения рибонуклеаз в исследуемых растворах этот метод можно использовать для количественной оценки РНКазной активности в экстрактах тканей. Для этого необходимо приготовить серию разведений раствора рибонуклеазы с известной концентрацией (активностью) и использовать их для построения калибровочной кривой. Регрессионный анализ показал, что взаимосвязь ферментативной активности и диаметром пятна описывается линейной моделью с высокой степенью точностиr²= 98% (см.рисунок).

В отличие от традиционных способов обнаружения и количественного определения активности РНКаз в растворах предлагаемый метод прост и безопасен как для здоровья конкретного исполнителя, так и для окружающей среды в целом. Кроме того, не требуется дополнительное дорогостоящее оборудование и редкие реактивы.