ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Фруктокиназа (К.Ф.2.7.1.4) катализирует реакцию фосфорилирования фруктозы

d-фруктоза + АТФ«d-фруктозо-6-фосфат + АДФ.

Принцип способа основан на определении убыли фруктозы в процессе ферментативной реакции.

В химически чистые центрифужные пробирки вносят 1,7 мл инкубационной среды, содержащей: 50 ммоль фосфатного буфера, рН 7,4, 2,7 ммоль фруктозы, 5 ммоль хлорида магния, 5,5 ммоль глюкозы, прибавляют 0,2 мл сыворотки крови. Реакция начинается после добавления 0,1 мл 100 ммоль/л АТФ. Пробы инкубируют в водяном термостате в течение 60 мин при 37 ⁰С. Реакцию останавливают прибавлением 8 мл кадмиевого раствора. Через 20 мин стояния проб добавляют 2 мл 1,1 н натрия гидроксида. Образующийся в результате обменной реакции между сульфатом кадмия и гидроксидом натрия гидроксид кадмия является хорошим осадителем белков. Через 20 мин смесь центрифугируют в течение 15 мин при 3000 об/мин. В центрифугате определяют содержание фруктозы резорциновым методом. Для этого к 1 мл полученного безбелкового супернатанта контрольных и опытных проб добавляют по 1 мл 0,1%-го раствора резорцина, приготовленного на 96%-м этаноле, и по 3 мл 30%-й соляной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой и ставят в водяной термостат при температуре 80 ⁰С. Через 8 мин пробы охлаждают и определяют интенсивность развития окраски на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм против холостого опыта. Параллельно ставят контрольную пробу, реакцию в которой останавливают кадмиевым реактивом до начала инкубации.

Разница между содержанием фруктозы в контрольной и опытной пробах дает представление об убыли фруктозы в процессе фруктокиназной реакции для исследуемой сыворотки крови.

Параллельно проводят определение содержания белка биуретовым методом.

Активность фермента выражают в ммоль фруктозы на 1 мг белка за 1 час инкубации.

Снижение активности фруктокиназы в сыворотке крови отмечается при заболеваниях печени.

Способ позволяет улучшить диагностику возможных заболеваний у животных, что в конечном итоге имеет значение для сохранения здоровья и поголовья высокопродуктивного стада.