ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Глюкозофосфатизомераза(К.Ф. 5.3.1.9) катализирует вторую реакцию гликолиза - взаимопревращения глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата

d-глюкозо-6-фосфат«d-фруктозо-6-фосфат.

Принцип способа основан на определении количества фруктозы по реакции с резорцином с образованием хромогена, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию образовавшейся фруктозы.

В химически чистые центрифужные пробирки вносят 1,8 мл инкубационной среды в составе 50 ммоль трис-НСlбуфера, рН 7,6, 2 ммоль натриевой или калиевой соли глюкозо-6-фосфата и ставят пробы на 10 мин в водяной термостат при температуре 37 ⁰С. В контрольную пробу предварительно прибавляют 2 мл 10%-ного раствора холодной трихлоруксусной кислоты. Далее в контрольные и опытные пробирки вносят фермент в виде 0,2 мл сыворотки крови. Пробы инкубируют в термостате в течение 60 мин при температуре 37 ⁰С. В опытной пробе реакцию останавливают прибавлением 2 мл 10%-го раствора холодной трихлоруксусной кислоты. Через 10 мин. стояния проб в холодильнике их центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин и в надосадочной жидкости определяют количество фруктозо-6-фосфата по реакции с резорцином. Для этого к 1 мл полученного безбелкового супернатанта (контрольных и опытных проб) добавляют по 1 мл 0,1%-го раствора резорцина, приготовленного на 96%-м этаноле и по 3 мл 30%-й соляной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой и ставят в водяной термостат при температуре 80 ⁰С. Через 8 мин пробы охлаждают и определяют интенсивность развившейся окраски на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм против холостого опыта. Данные фотометрирования контрольных проб вычитают из таковых опытных проб.

Расчет количества фруктозо-6-фосфата в пробах проводят с помощью калибровочного графика, построенного с использованием в качестве стандарта раствораd-фруктозо-6-фосфата.

Параллельно проводят определение в исследуемой сыворотке крови содержания белка биуретовым методом.

Активность глюкозо-фосфатизомеразы выражают в мкмоль фруктозо-6-фосфата на 1 мг белка за 1 ч инкубации.

Поскольку в эритроцитах содержание глюкозофосфатизомеразы в 100 раз выше, чем в сыворотке крови, очень важно избегать гемолиза при сборе крови для определения активности этого фермента.

Активность глюкозофосфатизомеразы в сыворотке крови и в тканях повышается при заболеваниях легочной и сердечно-сосудистой систем у животных.

Способ позволяет улучшить диагностику возможных заболеваний у животных, что в конечном итоге имеет значение для сохранения здоровья и поголовья высокопродуктивного стада.