ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Принцип способа основан на том, что липопротеины низкой плотности осаждаются гепарином в присутствии солей марганца и затем после центрифугирования отсасывают липопротеины высокой плотности, в которых определяют уровень тотальных липидов, холестерина и продукты перекисного окисления липидов.

Определение состоит из двух этапов: выделения липопротеинов высокой плотности и определения в них количества тотальных липидов, холестерина и интенсивности процессов перекисного окисления липидов.

В центрифужную пробирку вносят 1 мл исследуемой плазмы, 0,2 мл раствора гепарина (1000 ед./мл), 0,25 мл 1 М раствора хлорида марганца и инкубируют на льду в течение 30 мин. Затем пробу центрифугируют при 1500 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость, содержащую липопротеины высокой плотности, отсасывают, затем в ней определяют продукты перекисного окисления липидов, тотальные липиды и холестерин.

Определение тотальных липидов проводят по реакции с сульфованилиновым реактивом. К 0,02 мл надосадочной жидкости, содержащей липопротеины высокой плотности, прибавляют 1,5 мл концентрированной серной кислоты и кипятят в течение 15 мин на кипящей водяной бане. После охлаждения проточной водой берут 0,1 мл гидролизата и прибавляют 1,5 мл фосфорно-ванилинового реактива (в контрольную пробу вместо гидролизата берут 0,1 мл концентрированной серной кислоты). Тщательно перемешивают, выдерживают пробы при комнатной температуре в течение 50 мин. Оптическую плотность пробы (А ₁) и стандартного раствора (А ₂) измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 515 нм в кювете толщиной слоя 10 мм против контрольного раствора.

Расчет производят по формуле

Тотальные липиды (г/л) = 8 Ч А ₁/А ₂

где: 8 - концентрациястандартного раствора липидов, г/л.

Определение холестерина. К 0,1 мл надосадочной жидкости добавляют 2 мл 0,1%-го раствора хлорного железа в ледяной уксусной кислоте, содержимое хорошо перемешивают и выдерживают пробы в термостате при температуре +60 ⁰С в течение 15 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и определяют на фотоэлектроколориметре экстинкцию при 570 нм в кюветах с рабочей длиной 5 мм против раствора хлорного железа в ледяной уксусной кислоте.

Расчет проводят по калибровочной кривой с раствором, содержащим 1-2 ммоль/л холестерина (делают разведения из обычного стандартного раствора).

Определение продуктов перекисного окисления липидов. В центрифужные пробирки вносят 0,3 мл фракции липопротеинов высокой плотности (надосадочной жидкости), 0,3 мл 1%-й ортофосфорной кислоты, 0,1 мл 0,6%-го раствора 2-тиобарбитуровой кислоты и 0,1 мл раствора сульфата железа. Пробирки ставят в кипящую водяную баню на 1 ч. Пробы охлаждают холодной водой, добавляют 4 мл бутанола, тщательно перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 535 нм против бутанола (Е _оп).

Содержание малонового диальдегида (МДА) - продукта, характеризующего состояния перекисного окисления липидов, рассчитывают по формуле

МДА = Е _опЧ 10 ⁶Ч 4/К Ч 0,3

где: МДА - содержание малонового диальдегида, мкмоль/л;

4 - объем бутанольной фазы,

0,3 - объем фракции липопротеинов для анализа,

К - коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса малонового

диальдегида = 1, 56 Ч 10 ⁵ моль/см.

Снижение содержания холестерина липопротеинов высокой плотности либо повышение продуктов перекисного окисления липидов в липопротеинах высокой плотности свидетельствуют о нарушении липидного обмена и могут характеризовать заболевания печени у животных. Поэтому способ позволяет улучшить диагностику возможных заболеваний, что в конечном итоге имеет значение для сохранения здоровья и поголовья высокопродуктивного стада.