ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Принцип способа основан на том, что липопротеины низкой плотности осаждаются гепарином в присутствии солей марганца. Затем отделяют липопротеины высокой плотности, а в осадке находятся липопротеины низкой плотности, которые растворяют сульфатом аммония. Содержание белка и основных классов липидов определяют любым из известных методов.

Определение состоит из двух этапов: выделения липопротеинов из плазмы и определения химического состава выделенных липопротеинов.

В центрифужную пробирку вносят 1 мл исследуемой плазмы, 0,2 мл раствора гепарина (1000 ед./мл), 0,25 мл 1 М раствора хлорида марганца и инкубируют на льду в течение 30 мин. Затем пробу центрифугируют при 1500 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость, содержащую липопротеины высокой плотности, отделяют отсасыванием, а осадок, содержащий липопротеины низкой плотности, растворяют в 1 мл 2 М раствора сульфата аммония.

Затем в каждой из выделенных фракций липопротеинов определяют содержание общего белка, тотальных липидов, триацилглицеринов, фосфолипидов и холестерина.

Определение общего белка проводят биуретовым методом. К 0,04 мл добавляют 2 мл биуретового реактива и через 30 мин измеряют на фотоэлектроколориметре оптическую плотность (А ₁) и эталонного раствора (А ₂) при длине волны 540 нм в кювете толщиной слоя 10 мм против биуретового реактива. Расчет производят по формуле

Общий белок (г/л) = А ₁/А ₂Ч 80

где: 80 - концентрация белка в стандартном эталонном растворе, г/л.

Определение тотальных липидов проводят по реакции с сульфофосфованилиновым реактивом. К 0,02 мл растворенного осадка липопротеинов низкой плотности или надосадочной жидкости липопротеинов высокой плотности прибавляют 1,5 мл концентрированной серной кислоты и кипятят в течение 15 мин на кипящей водяной бане. После охлаждения проточной водой берут 0,1 мл гидролизата и прибавляют 1,5 мл фосфорно-ванилинового реактива (в контрольную пробу вместо гидролизата берут 0,1 мл концентрированной серной кислоты). Тщательно перемешивают, выдерживают пробы при комнатной температуре в течение 50 мин. Оптическую плотность пробы (А ₁) и стандартного раствора (А ₂) измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 515 нм в кювете толщиной слоя 10 мм против контрольного раствора.

Расчет производят по формуле

Общие липиды (г/л) = 8 Ч А ₁/А ₂

где: 8 - концентрация стандартного раствора липидов, г/л.

Определение фосфолипидов во фракциях осуществляют колориметрическим методом по содержанию липоидного фосфора. Для анализа берут 0,2 мл соответствующей фракции липопротеинов.

Определение триацилглицеринов проводят при помощи набора химреактивов и используют для анализа 0,1 мл образца соответственно липопротеинов низкой или высокой плотности.

Определение холестерина в липопротеиновых фракциях. К 0,1 мл образца осадка или надосадочной фракции добавляют 2 мл цветного реактива - 0,1%-го раствора хлорного железа в ледяной уксусной кислоте, содержимое хорошо перемешивают и выдерживают пробы в термостате при температуре +60 ⁰С в течение 15 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и определяют на фотоэлектроколориметре экстинкцию при 570 нм в кюветах с рабочей длиной 5 мм против цветного реактива.

Расчет проводят по калибровочной кривой с раствором, содержащим 1-2 ммоль/л холестерина (делают разведение из обычного стандартного раствора).

Нарушение липидного состава липопротеинов высокой и низкой плотности свидетельствует о нарушении обмена липидов и может характеризовать заболевания печени у животных. Поэтому способ позволяет улучшить диагностику возможных заболеваний, что в конечном итоге имеет значение для сохранения здоровья и поголовья высокопродуктивного стада.