ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Способ основан на том, что липопротеины низкой плотности осаждаются гепарином в присутствии солей марганца и затем после центрифугирования удаляются хиломикроны и липопротеины высокой плотности, которые находятся в надосадочной жидкости. Содержание общих липидов, холестерина и продуктов перекисного окисления липидов определяют любым из известных методов.

Определение состоит из двух этапов: выделения липопротеинов низкой плотности из плазмы и определения в них количества общих липидов, холестерина и продуктов перекисного окисления липидов.

В центрифужную пробирку вносят 1 мл исследуемой плазмы, 0,2 мл раствора гепарина (1000 ед/мл), 0,25 мл 1 М раствора хлорида марганца и инкубируют на льду в течение 30 мин. Затем пробу центрифугируют при 1500 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость, содержащую липопротеины высокой плотности, удаляют. Осадок, содержащий липопротеины низкой плотности, растворяют в 1 мл 2 М раствора сульфата аммония. Затем последовательно определяют общие липиды, холестерин и продукты перекисного окисления липидов.

Определение общих липидов проводят по реакции с сульфофосфованилиновым реактивом. К 0,02 мл растворенного осадка липопротеинов низкой плотности прибавляют 1,5 мл концентрированной серной кислоты и кипятят в течение 15 мин на кипящей водяной бане. После охлаждения проточной водой берут 0,1 мл гидролизата и прибавляют 1,5 мл фосфорно-ванилинового реактива (в контрольную пробу вместо гидролизата берут 0,1 мл концентрированной серной кислоты). Тщательно перемешивают, выдерживают пробы при комнатной температуре в течение 50 мин. Оптическую плотность пробы (А ₁) и стандартного раствора (А ₂) измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 515 нм в кювете толщиной слоя 10 мм против контроля.

Расчет производят по формуле

Общие липиды (г/л) = 8ЧА ₁/А ₂

где: 8 - концентрация стандартного раствора липидов, г/л.

Определение продуктов перекисного окисления липидов. В центрифужные пробирки вносят 0,3 мл растворенного осадка липопротеинов низкой плотности, 0,3 мл 1%-й ортофосфорной кислоты, 0,1 мл 0,6%-го раствора 2-тиобарбитуровой кислоты и 0,1 мл раствора сульфата железа. Пробирки ставят в кипящую водяную баню на 1 ч. Пробы охлаждают холодной водой, добавляют 4 мл бутанола, тщательно перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Измеряют оптическую плотность верхнего слоя на спектрофотометре при длине волны 535 нм против бутанола (Е _оп).

Содержание малонового диальдегида (МДА) - продукта, характеризующего состояние перекисного окисления липидов, рассчитывают по формуле

МДА = Е _опЧ10 ⁶Ч4/КЧ0,3

где: МДА - содержание малонового диальдегида, мкмоль/л;

4 - объем бутанольной фазы;

0,3 - объем фракции липопротеинов для анализа;

К - коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса малонового ди-

альдегида = 1,56Ч10 ⁵ моль/см.

Определение холестерина. К 0,1 мл растворенного осадка липопротеинов низкой плотности добавляют 2 мл 0,1%-го раствора хлорного железа в ледяной уксусной кислоте, содержимое хорошо перемешивают и выдерживают пробы в термостате при температуре +60 ⁰С в течение 15 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и определяют на фотоэлектроколориметре экстинкцию при 570 нм в кюветах с рабочей длиной 5 мм против раствора хлорного железа в ледяной уксусной кислоте.

Расчет проводят по калибровочной кривой с раствором, содержащим 2 ммоль/л холестерина.

Повышение продуктов перекисного окисления липидов, содержания холестерина липопротеинов низкой плотности, свидетельствует о нарушении липидного обмена и может характеризовать заболевания печени у животных. Поэтому способ позволяет улучшить диагностику возможных заболеваний, что в конечном итоге имеет значение для сохранения здоровья и поголовья высокопродуктивного стада.